NED373390NED

94 Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней и интерпретацию результатов реакции проводили в соответствии с ин- струкцией фирмы-производителя. Непрямой вариант ИФА. Метод последовательных разведений сыво- роток крови в ИФА проводили по общепринятой схеме с небольшими мо- дификациями. Рекомбинантный белок (концентрация 5 мкг/мл) адсорбиро- вали на 96-луночные полистироловые планшеты фирмы «Nunc» (Дания) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) по 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 16-18 ч при 4ºС. Затем отмывали 3 раза буфером PBST (на 1 л раствора: NaCl – 8,0 г; KCl – 0,2 г; Na 2 HPO 4 – 2,8 г; K 2 HPO 4 – 0,2 г; Tween-20 – 0,05%; рН 7,3). Лунки планшетов блокировали 10%-м раствором молока в PBST, внося по 100 мкл раствора в каждую из них, и инкубировали в течение часа – при 37ºС. Планшеты отмывали трех- кратно раствором PBST. Методом последовательных двукратных разведений одновременно с исследуемой сывороткой крови наносили отрицательную и положительную контрольные сыворотки, начиная с разведения 1:20. Инку- бировали планшеты в термостатируемом шейкере 1 ч при 37ºС. Повторили отмывку планшетов. Затем вносили также по 100 мкл на лунку антивидовой конъюгат (Sigma, США) в рабочем разведении и инкубировали планшеты в аналогичных условиях. После отмывки добавляли субстрат ABTS в том же объеме. Реакцию останавливали через 10-15 мин добавлением 1%-го раство- ра додецилсульфата натрия. Учет результатов производили на спектрофото- метре «SPECTRA SHELL» (Tecan, Австрия) при длине волны 405 нм. Таким образом, методом последовательных двукратных разведений сывороток крови в ИФА определяли титр антител в пробах. Титром иссле- дуемой сыворотки считали последнее ее разведение, в котором значение оптической плотности (ОП) вдвое превышало среднее значение оптиче- ской плотности отрицательного контроля. Непрямой вариант ИФА для выявления антител к A. pleuropneumoniae по одному разведению сывороток крови проводили по вышеприведенной схеме, но исследуемые и контрольные сыворотки вносили в буфере в раз- ведении 1:20. Методом одного разведения в ИФА определяли значение процента позитивности (ПП) по формуле: (ОП пробы – ОП К - ) / (ОП К + – ОП К - ) × 100%, где ОП пробы – оптическая плотность исследуемой сыворотки; ОП К - – оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки; ОП К + – оптическая плотность положительной контрольной сыворотки. Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека