NED373390NED

Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней 93 Материалы и методы Микроорганизмы. Для молекулярного клонирования гена ApxIV ис- пользовали штамм №27088 A. pleuropneumoniae из коллекции микроорга- низмов лаборатории микробиологии ФГУ «ВНИИЗЖ». Выделение бактериальной ДНК из суспензии осуществляли с исполь- зованием 6 М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых фильтров GF/F. ПЦР. Для проведения ПЦР собирали реакционную смесь, которая со- держала 5 мкл 10× буфера для Taq-полимеразы, 3 мМ Mg 2+ , 0,2 мМ dNTPs, 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы, по 20 пмоль праймеров, 5 мкл раствора бак- териальной ДНК и воду до конечного объема 50 мкл. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Германия). Программа включала 35 циклов ПЦР при следующем температурном режиме: 30 сек денатурации при 94ºС, 30 сек отжига праймеров при 55º С и 40 сек элон- гации при 72ºС. Продукты реакции анализировали с помощью электрофо- реза в 2,0% агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА. Молекулярное клонирование гена ApxIV осуществляли по общепри- нятым методикам (1). Экспрессия рекомбинантного белка. Культивирование Е. coli прово- дили в орбитальном шейкере при 150 об/мин и 37ºС. В дневную культуру клеток, достигшую логарифмической фазы роста, добавляли индуктор IPTG (Promega, США). Уровень экспрессии и размер рекомбинантного белка определяли с помощью электрофореза в 12%-м ПААГе. Сыворотки крови свиней . В качестве положительного контроля ис- пользовали сыворотку крови, в которой антитела к A. pleuropneumoniae были определены с помощью коммерческого набора «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX, США). В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сы- воротку, полученную от здорового животного, не имеющего антител к A. pleuropneumoniae . Для определения специфичности метода использовали сыворотки кро- ви от животных, имеющих антитела к Pasteurella multocida , Haemophillus parasuis , сальмонеллам, а также к вирусам репродуктивно-респираторного синдрома свиней и цирковирусу свиней 2-го типа. Для определения чувствительности метода применяли сыворотки крови от свиней с разным уровнем антител. Все сыворотки были проверены в ИФА с использованием коммерче- ского набора «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX, США). Постановку Электр нная На чная СельскоХозяйственная Библиотека