NED373390NED

72 Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней Материалы и методы Антиген. В работе использовали инактивированный концентриро- ванный антиген ротавируса свиней группы А серотипа G4 P7 (штамм «КR-47»), полученный в монослойных перевиваемых культурах клеток RSK и MARK-145. Вирусную суспензию подвергали замораживанию и оттаиванию с последующим центрифугированием при 3000 g в течение 15 минут для освобождения от клеточного детрита. После этого проводили концентрирование с помощью осаждения по- лиэтиленгликолем (ПЭГ 6000) и центрифугирования при 6000 g и 11000 g с последующим ультрацентрифугированием через слой 30%-го раствора сахарозы при 55000 g в течение 80 минут. Степень очистки контролирова- ли электронно-микроскопическим методом. Титр антигена определяли в непрямом сэндвич-варианте ИФА. При проведении непрямого варианта ИФА все компоненты реак- ции вносили в объёме 50 мкл/лунку. Разведения антигена готовили на 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,6. В качестве блоки- рующего буферного раствора применяли трис-буферный раствор (ТБР) рН 7,4-7,6 с 10% сыворотки крови лошади. Для разведения исследуемых проб сыворотки крови и конъюгата использовали 3% раствор лошадиной сы- воротки на промывочном буфере. Промывочный буфер готовили из трис- буферного раствора (ТБР) с добавлением 0,05% Tween-20. Между этапа- ми реакции несвязавшиеся компоненты удаляли путём промывания лунок планшета 3-4 раза промывочным буфером. Для выявления связавшихся антител использовали препарат антител против иммуноглобулинов сви- ньи, меченных пероксидазой хрена (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва). Индикацию проводили с помощью добавления хромоген-субстратного раствора АБТС (2,2’-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновая кислота) (Sigma). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «Уни- план» (г. Москва) при длине волны 405 нм. Разведения сывороток готовили с двукратным шагом от 1:20 до 1:2560. В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови свиней, специфичную к ротавирусу, с титром в непрямом варианте ИФА 1:160-640. В качестве отрицательного контроля использовали сыво- ротку крови свиней, не содержащую антител к ротавирусу, с титром в не- прямом варианте ИФА меньше, чем 1:20. Результаты анализа выражали в виде титра сыворотки. Титром сыворотки считали ее максимальное разве- дение, при котором величина оптической плотности в 2 раза превосходила Электронная Научная СельскоХозяйст енная Библиотека