47 / 68
45
ХРАНЕНИЕ и ПЕРЕРАБОТКА СЕЛЬХОЗСЫРЬЯ • № 12 • 2015
МикроТакс-Е. Дополнительные идентификационные
тесты ставили по общепринятым методикам. Бактерии
р.
Salmonella
выделялись из 50 г продукцииклассическими
методами с предварительным скринингом со среды пре-
добогащения методомПЦР в реальном времени на амп-
лификаторе RotorGen 6000 с использованием промыш-
ленной тест-системы.
Изучение адгезивной и пленкообразующей активнос-
ти штаммов проводили в стандартных 96‑луночных
полистироловых планшетах по общепринятой методике
[14]. Бактерии выращивали в среде LB в течение 18–24 ч
при температуре 37 °С. Затем микроорганизмы в дозе
10
7
мк/мл в количестве 200 мкл вносили в лунки план-
шета. Для каждого опыта использовали 3-4 повтора.
Инкубировали планшет в течение 1 сут при температуре
16 °С (температура близкая к производственной среде) и
37 °С. Среду с клетками удаляли из лунок, промывали
2-4 раза стерильным 0,85%-ным раствором NaCl для
удаления не прикрепившихся клеток и компонентов
среды. В каждую лунку вносили по 200 мкл 0,5%-ного
водного раствора кристаллического фиолетового и инку-
бировали планшет при комнатной температуре 15 мин.
После удаления несвязанного красителя лунки промы-
вали 3–4 раза дистиллированной водой до исчезновения
окраски.
Для количественного определения биопленки в каж-
дую лунку планшета добавляли 200 мкл 96%-ного этано-
ла, содержащего 2% уксусной кислоты (объем/объем),
инкубировали планшет при комнатной температуре
15 мин. Наличие и количество биопленки оценивали в
планшет-ридере БиоРад (
λ
=600 нм). Результаты пере-
считывали, определяя коэффициент пленкообразования:
К
бп
=
OD
опыта
/
OD
контроля
. Контрольные лунки учитывали
на каждом планшете. Окончательный результат оцени-
вали, используя критерии достоверности Стьюдента.
Было выделено и идентифицировано 13 доминирую-
щих штаммов, относящихся к четырем видам условно
патогенных представителей сем.
Enterobacteriaceae
(
E. coli,
K. pneumoniae, K. oxytoca, E. aerogenes
), один штамм был
отнесен к патогенным микроорганизмам р.
Salmonella
(ABCDE группы).
В своем большинстве изучаемые бактерии не демонс-
трировали единства по способности формировать био-
пленку даже в пределах одного вида и рода.
Максимальнуюпленкообразующуюактивностьпроявил
штамм
E. coli
1, приобоих температурных режимах (рис. 3).
Также обращает на себя внимание выделенныйштамм
р.
Salmonella
с высокой и средней пленкообразующей
активностью при 37 и 16 °С соответственно. При этом
музейныештаммыдемонстрировали слабуюспособность
кобразованиюпленок, более выраженнуюуштамма 1при
16 °С, что объясняется длительным его хранением при
низких температурах в стабильных условиях окружающей
среды (рис. 4).
Особуюнастороженность вызывает более выраженная
пленкообразующая активность у штаммов
K. oxytoca
1, 2,
3, 4 и у штаммов
E. aerogenes
1, 2 при 16°С (рис. 5, 6).
Можно предположить, что данные штаммы именно при
такой температуре сталкивались с крайне неблагоприят-
ными факторами окружающей среды (дезинфектанты,
биоциды различной природы, УФ-облучение), в резуль-
тате чего выработали стратегиюзащиты—формирование
биопленки.
Учитывая, что данныемикроорганизмыбылинаиболее
распространеннымии доминантнымив изучаемых образ-
цах продукции, можнопредположить контаминациюими
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
E. coli
1
E. coli
2
E. coli
3
К
бп
37 ° C 16 °C
Рис. 3.
Пленкообразующая активность штаммов E. coli
при различных температурных режимах
9,9
6,0
1,4 1,6
3,7
2,2
8
7
6
5
4
3
2
1
Salmonella sp. 1 Salmonella sp.
2
Salmonella sp.
3
К
бп
37 ° C 16 °C
Рис. 4.
Пленкообразующая активность музейных (1, 2)
и дикого штамма (3) р. Salmonella при различных
температурных режимах
1,7
2,8
2,1
1,6
6,8
3,9
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
K.pneumoniae K. oxytoca
1
K. oxytoca
2
K. oxytoca
3
K. oxytoca
4
К
бп
37 ° C 16 °C
Рис. 5.
Пленкообразующая активность штаммов p. Klebsiella
при различных температурных режимах
4,4
2,8
2,3 2,4
3,0
3,8
1,9
4,4
1,3
4,7
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
E. aerogenes
1
E. aerogenes
2
E. aerogenes
3
E. aerogenes
4
К
бп
37 ° C 16 °C
Рис. 6.
Пленкообразующая активность штаммов E. aerogenes
при различных температурных режимах
2,0
3,0
2,1
2,3
2,0
1,5
4,1
1,5
Электронн я Научная СельскоХозяйственная Библиотека