NED365343NED

59 3.8.3. Пиросеквенирование В 1985 году Robert Melamede описал новый метод секвенирования, основанный на принципе синтеза комплементарной цепи ДНК с помо- щью ПЦР реакции, и получивший название «пиросеквенирование» (рис. 3.9). Рис. 3.9. Принцип (слева) и графическое изображение результатов (справа) пиросеквенирования Двойная высота пика указывает на наличие двух одинаковых нуклеотидов в цепи ДНК (по http://pan.stanford.edu/section_html/PYRO/ ) Современный принцип этого метода заключается в том, что гото- вится реакционная смесь, которая содержит однонитевую ДНК, с при- крепленным к гомологичному сайту на ней, коротким праймером, ДНК- полимеразу, АТФ-сульфорилазу, люциферазу и апиразу. Четыре нук- леотида подаются в реакционную смесь в определенной очередности (например, CGAT). Если добавленный нуклеотид находит комплемен- тарную ему пару, то ДНК-полимераза встраивает этот нуклеотид в об- разующуюся цепочку, с высвобождением свободного пирофосфата. Свободный пирофосфат с помощью АТФ-сульфорилазы вместе с адено- зинфосфосульфатом превращаются в АТФ. Люцифераза, используя об- разованный АТФ и D-люциферин, вырабатывает видимый свет, кото- рый легко улавливается фотонным детектором пиросеквенатора. Избы- ток добавленного нуклеотида и образованного в ходе реакции АТФ раз- рушается апиразой. Апираза разрушает нуклеотиды также и в том слу- чает, когда добавленный нуклеотид не образует комплементарную пару, при этом ДНК-полимераза не встраивает нуклеотид в образующуюся цепочку и, как следствие, в результате последующих реакций видимый добавляемые нуклеотиды нуклеотидная последовательность