NED365343NED

58 может быть затруднено. В этом случае возможно неверное считывание информации и увеличение интенсивности регистрирующего сигнала для фрагмента ДНК мутантной формы примерно в два раза. 3.8.2. Масс-спектрометрия Хотя методы, основанные на разделении ДНК- последовательностей в ПААГ, являются достаточно чувствительными, они не вполне подходят для выявления полиморфизма на уровне еди- ничного нуклеотида (SNP) из-за относительно низкой производительно- сти, своей цены и получением большей, чем требуется, информации о нуклеотидной последовательности ДНК. Альтернативой гель- электрофоретическому анализу фрагментов ДНК при секвенировании, является масс-спектрометрия (Murray, 1996). При проведении масс- спектрометрического анализа фрагменты ДНК разделяются и анализи- руются по разнице их молекулярных масс. Преимущество данного ме- тода перед методом секвенирования по Sanger заключается в том, что при проведении масс-спектрометрии не требуется какого-либо мечения ДНК-фрагментов и их последующего разделения в ПААГ, что значи- тельно сокращает время на проведение анализа. Наиболее обещающие результаты получены при использовании масс-спектрометрии, основан- ной на матрично-лазерном десорбционно/ионизационном временно́м возбуждении (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight — MALDI-TOF). При проведения анализа полиморфизма SNP методом MALDI-TOF амплифицированные ПЦР-фрагменты улавливаются стрептовидином, прикрепленным к магнитным микрошарикам, с после- дующей обработкой их щелочью для образования однонитевой ДНК. Затем очищенная однонитевая ДНК гибридизуется с праймером, кото- рый прикрепляется к близлежащему к SNP-сайту. После этого в реак- цию добавляют один или два нуклеотида, которые последовательно присоединяются к праймеру. Причем присоединение нуклеотидов стро- го специфично и зависит от исследуемого SNP. Праймеры с присоеди- ненными нуклеотидами отделяются от матричной ДНК, и полученный продукт анализируется масс-спектрометрией. Различие в молекулярных массах, полученных продуктов ПЦР реакции, может быть очень точно определено. Однако существует и ряд ограничений применения этого метода при анализе геномов. Во-первых, MALDI-TOF методика требует для анализа использование очень чистых продуктов амплификации, то есть включает в себя целый комплекс очистки ПЦР-фрагментов до на- чала проведения их анализа масс-спектрометрией. Во-вторых, только лишь короткие фрагменты (до 100 п.н.) могут быть проанализированы с необходимой точностью.