NED365343NED

57 3.8.1. Биохимические методы ДНК-секвенирования В 1977 году практически одновременно были опубликованы два метода секвенирования ДНК. Первый метод основывался на биохими- ческой деградации цепочки нуклеотидов ДНК (Maxam, Gilbert, 1977). Во втором же методе использовалось ферментативное ингибирование продолжения синтеза цепочки нуклеотидной последовательности ДНК (Sanger et al., 1977). В обоих методах получались одноцепочечные нити ДНК, которые разделялись в полиакриламидном геле (ПААГ) по своим размерам. Метод, предложенный Maxam и Gilbert (1977) для получения набора секвенированных фрагментов ДНК, предполагал использование ядовитых химикатов. Кроме того, этот метод проигрывал по своим ос- новным показателям методу, предложенному Sanger et al. (1977). Благо- даря своим характеристикам метод секвенирования по Sanger получил наибольшее распространение, и все усилия в дальнейшем были направ- лены на последующее развитие и оптимизацию стратегии секвенирова- ния именно по этому методу. Автоматизация метода определения нук- леотидной последовательности ДНК по Sanger привела к еще большему прогрессу в развитии методов ДНК-секвенирования. В этом случае электрофоретическое разделение олигонуклеотидных цепочек в поли- аклиламидном геле было совмещено с выявлением флуоресцентно- меченых фрагментов нуклеиновых кислот после их облучения лазерным лучом. Существуют два основных принципа автоматического ДНК- секвенирования по Sanger, различающиеся по использованию одного или четырех разных красителей для мечения нуклеотидов в электрофо- ретически разделяемых фрагментах ДНК. В случае использования одно- го красителя, фрагменты ДНК метятся одним и тем же красителем в че- тырех различных реакциях (ddA, ddC, ddG и ddT), а затем разделяются в четырех различных дорожках ПААГ (Ansorge et al., 1986). Такой под- ход используется в приборе A.L.F. DNA sequencer TM фирмы Amerscham Biosciences (Piscataway, NJ, USA). Принцип четырех разных красителей, по одному для каждого нуклеотида (Smith et al., 1986), используется в приборе ABI Prism ® 377XL, производимом фирмой Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). В этом случае для разделения фрагментов ДНК используется всего одна дорожка в ПААГ и этим достигается высокая разрешающая способность. Кроме того, в последнем случае повышается производительность прибора. Развитие автоматических методов секве- нирования ДНК позволило количественно определять мутации и поли- морфизм на молекулярном уровне с точностью до одного нуклеотида. Однако в варианте, в котором мутантная последовательность ДНК сме- шена в образце с последовательностью дикого типа в отношении 1 : 1, использование метода четырех красителей при секвенировании ДНК