NED365343NED

51 Рис. 3.6. Схема AFLP анализа (по http://images.myshared.ru/4/100051/slide_21.jpg ) вания в 6 и 4 основания таких, например, как Eco RI и Mse I соответст- венно. Затем проводят лигирование липких концов рестрицированной геномной ДНК со специальными адаптерами — короткими двунитевы- ми фрагментами ДНК с известными последовательностями, имеющие на одном из своих концов гомологичные Eco RI или Mse I сайтам рест- рикции липкие окончания. Такие адаптеры добавляют по 20 оснований к обоим концам геномных фрагментов. На так называемом предвари- тельном или предселекционном этапе геномную ДНК с лигированными к ней адаптерами подвергают ПЦР амплификации, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, соответствующие известной последова- тельности адаптеров, но продленные их с 3´-конца (в направлении внут- ренней части фрагмента, который необходимо амплифицировать) про- извольным основанием. На этом этапе амплифицируют подмножество фрагментов, которые уже обладают основаниями комплементарными произвольным нуклеотидам. На втором этапе праймеры и ПЦР условия подбирают таким образом, чтобы благоприятствовать амплификации Eco RI- Mse I фрагментов и элиминировать Eco RI- Eco RI и Mse I -Mse I ампликоны. Наконец, проводят амплификацию, используя те же самые праймеры, но продленные на 3´ -конце двумя дополнительными произ- вольными основаниями. На этом этапе снова будут амплифицироваться, только фрагменты, имеющие сайты комплементации к произвольным основаниям. После проведения электрофоретического разделения в по- лиакриламидном геле можно выявить несколько десятков фрагментов (до 100), полиморфизм которых базируется на полиморфизме сайтов ре-