NED365343NED

49 ности ПЦР-амплификации. Однако, на наш взгляд, это не совсем оправ- дано. Например, методология, носящая название МААР (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling), заключает в себе элементы всех трех вы- шеназванных методических подходов или их разновидностей. Кроме того, исследователи часто совмещают различные этапы и элементы раз- личных методик и методологий, что тоже не может быть признано в ка- честве абсолютно нового методического подхода. Отличительной особенностью RAPD, DAF или AP-PCR является то, что они обычно дают доминантные маркеры. Причина этого в том, что во многих случаях исследователь имеет дело не с полиморфизмом длины фрагментов, а с полиморфизмом «присутствия–отсутствия» ам- пликона. Для подобного рода локуса амплификация фрагмента может быть или не быть. В таких условиях гомозиготы по аллелю «отсутствие полосы» идентифицируют со всей определенностью, в то время как по аллелю «присутствие полосы» наличие ампликона не позволяет делать различие между гетеро- и гомозиготой. Длина используемого праймера является одним из основных критериев, которые позволяют подразде- лять эти три метода, основанных на принципе МААР: от 5 до 15 нук- леотидов — это метод DAF, 9–10 — RAPD и от 18 до 32 — AP–PCR. Относительно последнего метода необходимо заметить, что вероятность найти случайным образом произвольную последовательность длиной в 20 или более оснований в большом геноме ничтожная мала. При этом если температура гибридизации будет понижена, могут происходить несовпадения (т. е. проявляется неполная комплиментация оснований праймера и матрицы), но только при таких условиях может происходить амплификация отдельных единичных или, в некоторых случаях, не- скольких десятков фрагментов. Если RAPD либо иной МААР маркер расположен недалеко от ге- на, подлежащего клонированию, или гена, наличие которого необходи- мо проследить на протяжении нескольких поколений в процессе селек- ции, то в таком случае маркер может стать специфичным для этого ло- куса. Для этого полосу вырезают из геля, ДНК секвенируют и затем на основе известной нуклеотидной последовательности синтезируют праймеры (примерно в 20 оснований), позволяющие специфично ам- плифицировать маркерный локус. Продукты такой амплификации ино- гда называют — амплифицированные районы охарактеризированной последовательности или SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regi- ons) (Paran, Michelmore, 1993). Для метода AFLP TM (рис. 3.6), который является более утончен- ным по своей методологии, процесс его реализации лучше контролиру- ется, чем в RAPD, DAF или AP-–PCR подходах (Vos et al., 1995). ДНК для начала разрезают двумя рестриктными ферментами с сайтами узна-