NED365343NED

48 (CA) n следовали за двумя–четырьмя случайно выбранными нуклеоти- дами, которые осуществляли сайт-специфичное прикрепление прайме- ров. При электрофоретическом разделении радиоактивно меченых ПЦР- продуктов, амплифицированных у различных эукариотических таксонов, авторам удалось получить не только межвидовой, но и внутривидовой полиморфизм. Таким образом, также как и в случае RFLP, проведение ПЦР ДНК-фингерпринтинга с помощью праймеров, созданных на основе простых повторяющихся повторов или микросателлитов, представляет собой удобный метод идентификации генотипа и генетического разно- образия у растений на различных уровнях ранжирования: от разнооб- разных биологических видов до отдельно взятых особей. Несмотря на то, что молекулярная основа вышеупомянутого полиморфизма до конца еще не выявлена, использование олигонуклеотидов в качестве прайме- ров для ПЦР взамен блот-гибридизационных проб при проведении RFLP анализа, является одним из важнейших преимуществ, значительно дополняющих и расширяющих методологическую базу исследователей. ПЦР ДНК-фингерпринтинг совмещает в себе высокую степень ДНК- полиморфизма, выявляемого обычными мультилокусными пробами при проведении блот-гибридизационного анализа, с технической простотой и скоростью метода ПЦР-идентификации, позволяющего проводить крупномасштабные эксперименты и анализы. Амплификация случайных полиморфных ПЦР–фрагментов (рис. 3.5), для получения ДНК ПЦР-фингерпринтов, как правило, осно- вывается на обычной ПЦР-методологии, с той лишь разницей, что в обычной ПЦР-реакции может использоваться только один праймер со случайной (неспецифичной) последовательностью. Однако использова- ние двух праймеров также возможно и это часто дает дополнительную информацию. В свое время было предложено несколько названий для ПЦР, при проведении которых использовали неспецифичные случайные праймеры. При этом каждая из таких ПЦР методик имела свой собст- венный протокол проведения анализа (см. обзор Caetano-Anolles et al., 1993). На сегодняшний день можно выделить три основные разновид- ности ПЦР анализа: 1) ПЦР со случайными праймерами (Arbitrarily Primed PCR — AP-PCR) (Welsh, McClelland, 1990) или полиморфизм длин случайно амплифицированных фрагментов ДНК (Random Amplified Polymorphic DNA — RAPD) (Williams et al., 1990; 1993), 2) ДНК амплифицированный фингерпринтинг (DNA Amplification Fingerprinting — DAF) (Caetano-Anolles et al., 1991) (не путать с ПЦР ДНК-фингерпринтингом) и 3) полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (Amplified Fragment Length Polymorphism — AFLP) (Vos et al., 1995). Некоторые исследователи выделяют еще и другие разновид-