NED365343NED

47 ные, полуспецифичные и неспецифичные праймеры могут быть приме- нены в любых комбинациях, их потенциал и возможности ПЦР-анализа, используемые для различных экспериментальных целей, становятся практически безграничными. Ввиду того, что в настоящем разделе мы не будем останавливаться на методологиях анализа генотипов (видов, популяций), которые требуют молекулярного клонирования или точной информации о геномной ДНК-последовательности, не будет рассматри- ваться и методология ПЦР ДНК-фингерпринтинга, основанная на спе- цифичных и полуспецифичных праймерах, за исключением методов, где используются в качестве праймеров простые тандемные повторы или микросателлиты, а также методов амплификации микросателлит- ных последовательностей с помощью специфичных фланкирующих (прилегающих) праймеров. Для ознакомления же с методологией ПЦР- амплификации с (полу)специфичными праймерами следует обратиться к практическим руководствам и пособиям, включая обзорные статьи, где эти подходы и методологии описаны достаточно подробно и после- довательно (Erlich, 1989; Innis et al., 1990; McPherson et al., 1991; Erlich et al., 1991; Arnheim, Erlich, 1992). 3.6. Методы ДНК-фингерпринтинга, основанные на ПЦР Олигонуклеотиды, содержащие простые повторяющиеся последо- вательности или коровую последовательность минисателлитных повто- ров, традиционно использовали в качестве проб при проведении обще- принятого ДНК-фингерпринтинга, основанного на Саузерн-блот гибри- дизации (Southern, 1975). Их применение в качестве ПЦР-праймеров для проведения ДНК-фингерпринтинга впервые описано Lieckfeldt et al. (1993), а также Meyer et al. (1993). В этих работах коровая последова- тельность фага дикого типа М13 (GAGGTGGUGGUTCT), также как и простые повторяющиеся последовательности (CA) 8 , (CT) 8 , (CAC) 5 , (GTG) 5 , (GACA) 4 и (GATA) 4 были использованы в качестве ПЦР прай- меров для идентификации различных изолятов Cryptococcus neoformans — патогенного грибка человека. Этот подход, основанный на относи- тельно простой идее использования олигонуклеотидов в качестве прай- меров, позволил выявить своеобразные многофрагментные профили, полученные в результате ПЦР амплификации для различных видов гри- бов и растений (Matsuama et al., 1993; Neuhaus et al., 1993). Однако, не- смотря на обнаруженный полиморфизм между исследуемыми видами, внутри видовой полиморфизм при этом не был обнаружен. В середине 1990-х гг. Zietkiewicz et al. (1994), используя в качестве праймера 5’– или 3’-специфичную простую повторяющуюся последовательность (олигонуклеотид), описали новую модификацию этого метода. В ис- пользованных ими олигонуклеотидных праймерах повторы (TG) n или