NED365343NED

45 пени) выбора рестрикционной эндонуклеазы при проведении блот- гибридизационного ДНК-фингерпринтинга. 3.5. Стратегия методов ПЦР ПЦР-методология, основанная на ферментативной амплификации ДНК in vitro, была предложена в середине 1980-х годов (Saiki et al., 1985). При использовании в качестве матрицы небольшого количества исходной ДНК (обычно десятки нанограммов) возможно амплифициро- вать миллионы копий одного или нескольких ДНК-фрагментов (рис. 3.4). Амплифицированные фрагменты обычно разделяют электро- форезом в агарозном или полиакриламидном геле и затем окрашивают специальным красителем или подвергают радиоавтографии. Метод ПЦР отличается высокой скоростью, селективностью и достаточно высокой чувствительностью. Его применение в различных вариациях и для са- мых различных целей открыло новые возможности для решения самых разнообразных задач молекулярной биологии, генетики и селекции. Одним из основных достоинств ПЦР-методологии является то, что, в зависимости от целей исследования, можно выбрать любую раз- новидность праймеров. С одной стороны, специфичную последователь- ность ДНК можно амплифицировать с помощью пары специфичных праймеров, последовательность которых выбирается на основе и в соот- ветствии с известной последовательностью, которую предстоит ампли- фицировать. Такая стратегия наиболее приемлема для выделения генов или анализа трансгенов в трансгенных организмах. Специфичные прай- меры, уникальные по своей последовательности, фланкирующие (при- лежащие) простые тандемные повторы (например, микросателлиты) достаточно часто используют в геномном картировании и в популяци- онной генетике. С другой стороны, неизвестная последовательность ДНК может быть амплифицирована с помощью случайных, неспеци- фичных (или произвольных) праймеров. Хотя выбор нуклеотидной по- следовательности такой пары праймеров совершенно случаен, опреде- ленные фрагменты матричной ДНК обычно амплифицируются в соот- ветствующих условиях проведения реакции ПЦР. Эта стратегия также вполне приемлема для проведения геномного картирования и ДНК- фингерпринтинга. Между этими двумя крайними случаями выбора ПЦР-праймеров существует несколько возможностей создания, выбора и применения полуспецифичных праймеров. Например, в некоторых стратегиях ис- пользуют праймеры, комплементарные известным повторяющимся по- следовательностям ДНК. Эти последовательности включают разбросан- ные по геному ДНК-повторы, такие как: гены, кодирующие 5S РНК (Kolchinsky et al., 1991) и тРНК (Welch, McClelland, 1991), участки ин-