NED365343NED

41 становится возможным благодаря тому, что комплементарные нити ДНК обладают способностью гибридизоваться друг с другом. Даже в очень большом по своим размерам геноме данная проба будет гибри- дизоваться только с комплементарной ей последовательностью и ни с какой больше. С помощью пробы специфично помеченной радиоак- тивно или химически (например, биотинилированием) желаемый фраг- мент может быть идентифицирован. Обычно в качестве проб использу- ют клонированные фрагменты геномной ДНК (гнДНК) и комплемен- тарные или клонированные ДНК (кДНК). В отличие от гнДНК-проб пробы кДНК в обязательном порядке соответствуют экспрессирован- ным генам. Для этого матричные РНК (мРНК) выделяют из данного ор- гана или ткани и комплементарную им ДНК синтезируют с помощью фермента обратной транскриптазы, а полученные кДНК клонируют, чтобы потом использовать в качестве проб. По сравнению с гнДНК кДНК обычно выявляет высокий процент уникальных локусов, но это также зависит и от исследуемого вида растений. Пробы геномной ДНК изучаемых видов получают разрезанием высокомолекулярной ДНК, как правило, ядерного генома с помощью специфичного рестриктного фермента. Для того чтобы длина образуе- мых рестрикных фрагментов была сопоставима с длиной, позволяющей проводить клонирование или амплификацию in vitro (например, с по- мощью ПЦР), обычно для переваривания ДНК выбирают фермент, рас- познающий шесть п.о. в сайте рестрикции. Но геном высших растений, как правило, содержит значительные количества повторяющейся ДНК (повторов) (Morante, Olivieri, 1993; Toth et al., 2000). Более того, такая ДНК часто не экспрессируется, так что рестриктный фермент всегда «нарезает» много лишних фрагментов, причем большинство из них не содержит никаких генов. Для того чтобы обойти этот недостаток, мож- но использовать такие ферменты, которые чувствительны к метилиро- ванию (табл. 3.1). Идея основывается на том, что экспрессирующиеся районы намного меньше метилированы, чем повторяющиеся, часто молчащие, локусы. Такие ферменты как Pst I будут генерировать или производить очень большие фрагменты в метилированных повторяю- щихся районах и маленькие фрагменты в районах с генами, которые редко или никогда не повторяются. По сравнению обычными геномны- ми библиотеками библиотеки геномных ДНК-проб, полученных с по- мощью Pst I, как правило, «насыщены» однокопийными последователь- ностями (табл. 3.2). Существуют два основных различия между обычной RFLP мето- дологией и основанным на RFLP ДНК-фингерпринтингом: 1) в ДНК- фингерпринтинге (в том смысле, что мы употребляем здесь), обычно используют мультилокусные пробы, дающие при блот-гибридизации по