NED365343NED

39 Следовательно, если нуклеотидные основания A, T, G и C встречаются в ДНК с равной частотой, то фермент, имеющий сайт узнавания в 6 ос- нований, будет разрезать ДНК в среднем каждое 4096 основание (4 6 ). Таким образом, геном размером в 10 9 пар оснований (п. о.) будет проду- цировать около 250000 фрагментов различной длины. Открытие рестрикционных эндонуклеаз, вместе с открытием ДНК-лигаз, дало импульс к развитию технологий клонирования ДНК, которое, в свою очередь, во второй половине 1970-х годов послужило предпосылкой появления техники ДНК-секвенирования. Сами сайты, которые узнаются рестрикционными эндонуклеазами, могут быть по- лиморфными. Если один или более нуклеотидов в сайте, распознавае- мом эндонуклеазой, изменен, то фермент сможет «распознать» неизме- ненные аллельные варианты, что выразится в появлении различных по своей молекулярной массе и размерам ДНК-фрагментов. Специфич- ность заключается в том, что замена одного основания в сайте рестрик- ции оказывается достаточной для ингибирования нуклеазной активно- сти фермента, используемого для переваривания ДНК. Такого рода спе- цифичность применяется для выявления или определения полиморфиз- ма: присутствие или отсутствие сайта рестрикции приводит к полимор- физму фрагментов ДНК, различающихся друг от друга по своей длине (Southern, 1975). На основе такой методологии, получившей название полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism — RFLP) (рис. 3.3), может быть проведен анализ сцепления генов (Botstein et al., 1980). Дополнительно к анализу сцепле- ния RFLP-анализ может быть использован для оценки полиморфизма на уровне единичного нуклеотида (SNP). Феномен полиморфизма сайтов рестрикции не является редко- стью. Очень быстро был идентифицирован целый ряд специфичных ре- стрикционных эндонуклеаз, которые расщепляли ДНК в определенных для данных нуклеаз сайтах рестрикции (Smith, Wilcox, 1970). C тех пор рестрикционные эндонуклеазы, которые расщепляют специфичные по- следовательности ДНК, были выделены из нескольких сотен бактери- альных штаммов. Поскольку полиморфизм последовательности нуклео- тидов является одним из основных свойств живых существ, то разреза- ние ДНК любых двух особей данного вида (или видов) дает большое число различий по длине фрагментов. Несмотря на то, что получить по- лиморфные фрагменты легко, визуально определить их полиморфизм довольно трудно. Фактически, электрофорез продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле, с последующей визуализацией с помощью прокрашивания ДНК бромистым этидием или нитратом серебра, не по- зволяет различить индивидуальные (отдельные) фрагменты, поскольку