NED354493NED

11.6.4. О п р ед ел ен и е ак ти в н ости н и тр и тр едук тазы (НАД(Ф) • Н2: нитрит-оксидоредуктаза. КФ 1.6.6.4) Принцип метода. В результате действия нитритредуктазы нитриты превращаются в гидроксиламин и в гидрат окиси аммония. Нитриты образу­ ются в почве в начальной стадии восстановления нитратов: 7НАД(Ф) Н 2 + 2 N 0 2" = 7НАД(Ф) + 2 NH 4 OH + 2Н 2 0 . Метод определения основан на способности нитритов при взаимодействии с сульфаниловой кислотой и а-нафтиламином (реактив Грисса) в кислой среде давать красную окраску. Ход анализа. Навеску просеянной воздушно-сухой почвы массой 1,0 г помещают в круглодонную колбу объемом 100 см 3 с притертой стеклян­ ной пробкой. В колбу прибавляют 20 мг С аС 03, перемешивают, встряхивают, приливают пипеткой 1 см 3 0,5 %-ного раствора K N 0 3, 1 см 3 1 %-ного раство­ ра глюкозы в качестве донора водорода. Воздух из колбы эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт. ст., встряхивают колбу и ставят ее в термостат при температуре 30 °С на 24 часа. В качестве контроля используют стерилизован­ ную при температуре 180 °С в течение 3 часов почву с реактивами. После инкубации в термостате в колбу приливают мерным цилиндром 50 см 3 дистиллированной воды, пипеткой 1 см 3 насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов, содержимое перемешивают и фильтруют через плотный бумажный фильтр. Затем пипеткой берут 1 см 3 фильтрата в мерную колбу объемом 50 см3, приливают цилиндром 5 см 3 дистиллированной воды, добавляют пипеткой 4 см 3 реактива Грисса, доводят дистиллированной водой объем до метки и перемешивают. Колориметрируют на фотоэлектроколори­ метре через 15-20 минут после перемешивания при длине волны 540 нм (зе­ леный светофильтр). Количество нитритов находят по калибровочному графику. Затем рассчитывают его по разнице между количеством N 0 2", внесенного в инку­ бационную смесь с 1 см 3 0,5 %-ного раствора K N 0 3 (в 1 см 3 0,5 %-ного рас­ твора K N 0 3 содержится 3,33 мг N 0 2"), и обнаруженного в фильтрате нитрита. Построение калибровочного графика. В мерные колбы емкостью 50 см 3 приливают определенное возрастающее количество рабочего образцо­ вого раствора N aN 0 2 (х. ч.), содержащего в 1 см 3 0,005 мг N 0 2", и осуществ­ ляют все операции как и при анализе опытной почвы. Запасной образцовый раствор N aN 0 2 готовят следующим образом: на аналитических весах взвеши­ вают 0,2463 г N aN 0 2, помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки. В 1 см 3 запас­ ного образцового раствора N a N 0 2 содержится 0,5 мг N -N 0 2. Рабочий образ­ цовый раствор N a N 0 2 готовят разведением запасного рабочего раствора в 100 раз. На оси абсциссы откладывают содержание нитритного азота в соот­ ветствующем объеме рабочего образцового раствора N a N 0 2, на оси ординаты - величины оптической плотности. Вычисление результатов анализа. Активность нитритредуктазы рассчитывают по формуле: а ■р Х = — , ш 103